Struttura dell'OMEGA nickasi IsrB in complesso con ωRNA e DNA bersaglio

May 06, 2023

Natura volume 610, pagine 575–581 (2022)Citare questo articolo

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I sistemi guidati da RNA, come CRISPR–Cas, combinano il riconoscimento programmabile del substrato con la funzione enzimatica, una combinazione che è stata utilizzata vantaggiosamente per sviluppare potenti tecnologie molecolari1,2. Gli studi strutturali di questi sistemi hanno illuminato il modo in cui l'RNA e le proteine ​​riconoscono e scindono congiuntamente i loro substrati, guidando l'ingegneria razionale per l'ulteriore sviluppo tecnologico3. Un lavoro recente ha identificato una nuova classe di sistemi guidati da RNA, chiamati OMEGA, che includono IscB, il probabile antenato di Cas9, e la nickasi IsrB, un omologo di IscB privo del dominio nucleasi HNH4. IsrB è costituito solo da circa 350 amminoacidi, ma le sue piccole dimensioni sono controbilanciate da una guida di RNA relativamente grande (circa 300 nt ωRNA). Qui, riportiamo la struttura al microscopio elettronico criogenico di Desulfovirgula termocuniculi IsrB (DtIsrB) in complesso con il suo ωRNA affine e un DNA bersaglio. Troviamo che la struttura complessiva della proteina IsrB condivide un'impalcatura comune con Cas9. A differenza di Cas9, tuttavia, che utilizza un lobo di riconoscimento (REC) per facilitare la selezione del bersaglio, IsrB fa affidamento sul suo ωRNA, parte del quale forma un'intricata struttura ternaria posizionata analogamente a REC. Le analisi strutturali di IsrB e del suo ωRNA, nonché i confronti con altri sistemi guidati dall’RNA, evidenziano l’interazione funzionale tra proteine ​​e RNA, facendo avanzare la nostra comprensione della biologia e dell’evoluzione di questi diversi sistemi.

La proteina IsrB guidata dall'RNA è un membro della famiglia OMEGA codificata nella superfamiglia dei trasposoni IS200/IS605. IsrB è il probabile antecedente di IscB, un altro membro della famiglia OMEGA che è l'apparente antenato di Cas9, come indicato sia dall'analisi filogenetica che dall'architettura del dominio unico condiviso4,5. Come IscB e Cas9, IsrB contiene un dominio nucleasi simile a RuvC che viene interrotto dall'inserimento di un'elica a ponte (BH) (Fig. 1a). Tuttavia, a differenza di IscB e Cas9, IsrB è privo del dominio della nucleasi HNH, del lobo REC e di ampie porzioni del dominio interagente con il motivo adiacente al protospacer (PAM) e, di conseguenza, è molto più piccolo (con circa 350 aminoacidi) di Cas9 . IsrB contiene inoltre un dominio PLMP N-terminale (dal nome del suo motivo amminoacidico conservato) e un dominio C-terminale non caratterizzato (Fig. 1b). Lavori precedenti hanno dimostrato che IsrB si associa a un ωRNA di circa 300 nt, che guida IsrB a intaccare il filamento non bersaglio del DNA a doppio filamento (ds) contenente un motivo bersaglio adiacente 5′-NTGA-3′ (TAM)4 .

a, Architettura del locus e RNA guida per IsrB (a sinistra) e Cas9 (a destra). b, Architettura del dominio di Streptococcus pyogenes SpCas9 (in alto) e D. thermocuniculi IsrB (DtIsrB) (in basso). c, Schema di IsrB in complesso con l'ωRNA e il DNA bersaglio. Il duplex parziale del DNA contenente il TAM e le sequenze target utilizzate per lo studio strutturale sono mostrati in lettere di sequenza. d, e, mappa di densità Cryo-EM (d) e modello strutturale (e) del complesso DNA bersaglio IsrB-ωRNA. Le linee tratteggiate rappresentano regioni di ωRNA scarsamente risolte. TE, fine del trasposone; DR, ripetizione diretta; NUC, nucleasi; PI, interagente con PAM; PLL, circuito ad aggancio fosfato; TI, TAM-interagente; TS, filamento bersaglio; NTS, filamento non bersaglio.

Per caratterizzare il meccanismo molecolare del targeting del DNA guidato da ωRNA da parte di IsrB, abbiamo analizzato un complesso ternario comprendente Desulfovirgula termocuniculi IsrB (DtIsrB), un ωRNA da 284 nt contenente un segmento guida da 20 nt, un filamento di DNA bersaglio da 31 nt e un filamento di DNA bersaglio da 10 -nt filamento di DNA non bersaglio utilizzando crio-EM a particella singola (Fig. 1c). Abbiamo ottenuto una ricostruzione tridimensionale (3D) del complesso ternario con una risoluzione complessiva di 3,1 Å (Fig. 1d, Dati estesi Fig. 1a-c e Tabella dati estesi 1). Alcune regioni della mappa corrispondenti all'ωRNA, tuttavia, sono state risolte con una risoluzione inferiore. Per perfezionare la modellazione delle coordinate dell'RNA, abbiamo utilizzato uno strumento di modellazione specifico dell'RNA, auto-DRRAFTER, insieme a un modello di struttura secondaria basato sulla covarianza per costruire un modello iniziale di ωRNA. Sulla base di questo modello ωRNA e di un modello IsrB iniziale generato dalla previsione della struttura proteica, abbiamo determinato la struttura IsrB-ωRNA-DNA (Fig. 1e e Figg. Dati estesi 1d, e e 2)6,7,8.